طراحی و ساخت وکتور بیانی جدید در مخمر pichia pastoris دارای پروموتر القایی fmd وتوالی histag

عنوان: طراحی وساخت وکتور بیانی جدید در مخمر pichia pastoris دارای پروموتر fmd سلول های مخمری با توجه به میزان بیان بالا و سرعت رشد مناسب، میزبان های ایده آلی برای تولید پروتئین های نوترکیب در صنعت محسوب می شوند. از مخمرهای صنعتی می توان به مخمر متیلوتروف pichia pastoris اشاره کرد. اغلب برای بیان پروتئین نوترکیب در مخمر p. pastoris از پروموتر قوی و القایی aox1 استفاده می شود. یکی از مشکلات استفاده از این پروموتر، اضافه کردن دائمی متانول به عنوان القاکننده در محیط کشت بیانی و افزایش خطر اشتعال و همچنین هزینه های تولید می باشد. در اینجا از پروموتر قوی و القایی fmd در ساختار وکتور بیانی مخمر استفاده شد؛ که این پروموتر در غلظت های پائین گلوکز القا شده و بیان ژن تحت کنترل خود را انجام خواهد داد. از وکتور بیانی ppink?-hc به عنوان وکتور پایه استفاده شد که دارای پروموتر aox1 و سیگنال پپتید ترشحی mf? در بالادست جایگاه کلونینگ و ترمیناتور cyc1 در پائین دست آن می باشد. پس از تعیین نمودن توالی پروموتری fmd و سیگنال پپتید ترشحی mf? و همچنین طراحی سایت های برشی، توالی نهایی در وکتور puc57 سنتز شد. هضم آنزیمی بر روی پلاسمید puc57-fmd-mf? با آنزیم های محدود کننده bamhi و kpni انجام شد و قطعه ژنی fmd-mf? با اندازه 1380 جفت باز از روی ژل آگاروز جدا گردید. در ادامه هضم آنزیمی وکتور بیانی مخمری ppink?-hc جهت حذف پروموتر aox1 با آنزیم های محدود کننده bglii و kpni انجام شد و کلونینگ قطعه fmd-mf? در وکتور ppink-aox1- انجام گردید. صحت ساختار وکتور جدید با تعیین توالی تایید شد.